41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮"是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？

答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。

42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE， 濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和PVDF膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的PVDF膜（0.2微米）。

44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請(qǐng)問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。

答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。

45、是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？

答：半定量實(shí)驗(yàn)需要有內(nèi)參。

46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？

答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。

47、做半定量Western Blot，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個(gè)好？

答：兩者均可。

48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？

答：一般來說提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。

49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉"，其中TBST最后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?

答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過夜。

51、請(qǐng)問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

答：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素：

（1）電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55v，分離膠75v就能跑得很好。

（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.

53、為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì)丟失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過程中，會(huì)透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。

54．電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：

●︶ 條帶呈笑臉狀

原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高。

●︵ 條帶呈皺眉狀

原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不*。

●拖尾

原因：樣品溶解不好。

●紋理（縱向條紋）

原因：樣品中含有不溶性顆粒。

●條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

●條帶兩邊擴(kuò)散

原因：加樣量過多。

55．Western blot結(jié)果中背景較高

可能的原因及建議：

●膜封閉不夠

延長(zhǎng)封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液。

●一抗稀釋度不適宜

對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最適宜的抗體稀釋度。

●一抗孵育的溫度偏高

建議4℃結(jié)合過夜。

●選擇的膜容易產(chǎn)生高背景

一般硝酸纖維素膜的背景會(huì)比PVDF膜低。

●膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過

實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤(rùn)。

●檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過長(zhǎng)

減少曝光時(shí)間。

56．Western blot結(jié)果中雜帶較多

可能的原因及建議：

●目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。

查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。

●樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解

加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。

●上樣量過高，太敏感

適當(dāng)減少上樣量。

●一抗特異性不高

重新選擇或制備高特異性的抗體。

●一抗不純

純化抗體

●一抗或者二抗?jié)舛绕?/span>

降低抗體濃度。

57 . Western blot結(jié)果中無信號(hào)或顯示信號(hào)弱

可能的原因及建議：

●檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白

選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性。

●檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白

提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。

●轉(zhuǎn)移不*或過轉(zhuǎn)移

可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。

●抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白

購買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。

●一抗孵育時(shí)間不足

建議4℃結(jié)合過夜。

●二抗與一抗不匹配

選擇針對(duì)一抗來源的種屬的抗體。

●洗膜過度

洗膜時(shí)間不宜過長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

58. 其它現(xiàn)象：

●膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑

原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。

●反白（條帶顯白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/span>

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

59．安全問題：

操作有毒試劑時(shí)，帶手套，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。